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头疼┃qPCR、RT-PCR、RT-qPCR傻傻分不清!

人阅读 发布时间:2020-09-18 14:48

回想小编当年研究生刚第一学期的场景,真的是一把心酸泪啊,记忆最深刻的就是qPCR、RT-PCR、RT-qPCR了,当时真的傻傻分不清,为了让大家不再因为他们而头疼,今天我们就来一一把他们攻破。

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加。因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想,1985年由其发明了聚合酶链反应,即简易DNA扩增法,意味着PCR技术的真正诞生。到如今,PCR已发展到第三代技术。1973 年,台湾科学家钱嘉韵,发现了稳定的Taq DNA聚合酶,为PCR技术发展也做出了基础性贡献。

  
  • qPCR&RT-PCR
 其实Real-time-PCR和 qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR )是一码事,都是实时荧光定量PCR,指的是PCR过程中每个循环都有数据的实时记录,因此可以对起始模板数量进行精确的分析。 虽然Real-time PCR(实时荧光定量PCR)和Reverse transcription PCR(反转录PCR)看起来都可以缩写为RT-PCR,但是,国际上的约定俗成的是:RT-PCR特指反转录PCR,而Real-time PCR一般缩写为qPCR(quantitative real-time PCR),所以,师兄下次再跟你说qPCR的时候,不要再追问说的到底是哪个PCR了。 具体来说,实时荧光定量PCR反应指的是在PCR进行的同时,对其过程进行监测(即实时),一般简写为(qPCR)。实时定量PCR与终点PCR(Endpoint PCR)的区别在于数据可在PCR扩增过程中进行收集。在实时荧光定量PCR中,反应以循环中首次检测到目标扩增的时间点为特征,目标核酸的起始拷贝数越高,则会越快观察到荧光的显著增加(扩增曲线越靠近的X值越低)。相反,终点法检测(也称 “读板检测”)测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。 RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用,从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。RT—PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。ps:无论使用何种RNA,都要确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。  
  • RT-qPCR
 还有real-time RT-PCR,其实就是平时看到的RT-qPCR,real-time RT-PCR中间的“RT”指的是 reverse transcription(逆转录),整个意思就是利用 mRNA 或总RNA为模板的实时逆转录PCR技术(quantitative Real-time RT-PCR)。real time RT-PCR指的是 qPCR+RT-PCR的组合,是说将mRNA逆转录为cDNA后再作为模板进行实时荧光PCR分析,因为RT-PCR是可以定性的,但不能进行定量检测的。 所以说real-time RT-PCR(RT-qPCR) 就是结合了荧光定量技术的反转录PCR:先从 RNA 反转录得到 cDNA(RT),然后再用 Real-time PCR进行定量分析(qPCR)。  需要注意的是qPCR不一定与反转录相关,除了可以用cDNA作为模板,也可以用基因组 DNA等作为模板。而反转录PCR也不一定非要与荧光定量相关,从mRNA中反转录得到cDNA,然后PCR扩增出目的基因,这也是反转录PCR。 因此,那RT-qPCR(也有人写成qRT-PCR)就很好理解了,就是结合了荧光定量技术的反转录PCR,即:先从RNA反转录得到cDNA(RT),然后用Real-time PCR进行定量分析(qPCR)。

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